ES細(xì)胞打靶
2022-08-14
傳統(tǒng)ES打靶基因敲除：構(gòu)建周期長達(dá)12個月，存在嵌合體階段
傳統(tǒng)ES打靶基因敲除因嵌合體陽性率較低，并且需要與工具鼠交配才能獲得刪除Neo的雜合子，因此構(gòu)建周期長達(dá)10-12個月。如何跨越“嵌合體”階段并自刪除Neo以減少兩代繁育時間，才是真正快速的關(guān)鍵。
設(shè)計(jì)優(yōu)化后：實(shí)現(xiàn)跨越“嵌合體”階段且自刪除Neo，減少兩代繁育時間
因此周期與cas9構(gòu)建相近，半年即可
ES打靶技術(shù)優(yōu)勢：
1、基因修飾準(zhǔn)確、效果穩(wěn)定；
2、沒有脫靶效應(yīng)，可勝任復(fù)雜的基因敲除；
3、自刪除Neo可進(jìn)一步縮短服務(wù)周期，簡化了小鼠交配流程。
服務(wù)流程
小鼠品系
ES細(xì)胞品系：C57BL/6N、BALB/c品系
基因敲除小鼠模型
完全性基因敲除小鼠
完全性基因敲除是通過基因敲除技術(shù)，把需要敲除目的基因的所有外顯子或幾個重要的外顯子或者功能區(qū)域敲除掉，獲得全身所有的組織和細(xì)胞中都不表達(dá)該基因的小鼠模型。
應(yīng)用
用于研究某個基因（要求該基因非胚胎致死性基因）對全身生理病理的功能。
條件性基因敲除小鼠
條件性基因敲除是通過把兩個LoxP位點(diǎn)插入到目的基因的一個或幾個重要外顯子的兩端以制備出有兩個loxP位點(diǎn)的TurboKnockout-floxed小鼠，TurboKnockout-floxed小鼠在與表達(dá)Cre重組酶小鼠雜交之前，目的基因表達(dá)完全正常；而當(dāng)TurboKnockout-floxed小鼠與組織特異性表 達(dá)Cre酶的小鼠進(jìn)行雜交后，可以在特定的組織或細(xì)胞中敲除該基因，而該基因在其它組織或細(xì)胞表達(dá)正常。
應(yīng)用
1、用于具有胚胎致死性目的基因的研究；
2、用于研究基因在特定的組織或細(xì)胞中的生理病理功能；
3、與控制Cre表達(dá)的其它誘導(dǎo)系統(tǒng)相結(jié)合，還可以對某一基因的表達(dá)同時實(shí)現(xiàn)在時間和空間兩方面的調(diào)控。
基因敲入小鼠
基因敲入可以在目的基因位置引入特定的突變或外源基因。比如在目的基因上引入點(diǎn)突變(模擬人類遺傳疾病模型) ；或?qū)?bào)告基因(如EGFP，mRFP，mCherry，mYFP，或LacZ等)通過同源重組的方式引入目的基因的特定位點(diǎn)，從而可以通過報(bào)告基因來跟 蹤目標(biāo)基因的表達(dá)。也可以用報(bào)告基因取代小鼠本身的基因，使KO/KI同時發(fā)生。
應(yīng)用
1、用于藥物篩選相關(guān)研究；
2、用于信號通路的研究；
3、用于示蹤的相關(guān)研究。
人源化小鼠
人源化小鼠模型是指帶有功能性的人類基因、細(xì)胞或組織的小鼠模型。這種模型通常被用于人類疾病體內(nèi)研究(in vivo study)的活體替代模型。由于人類生理與動物生理有顯著的差別，利用動物模型得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有時不能適用到人體上。比如， 有些利用小鼠等動物模型開發(fā) 的藥物在人體上并沒有效果。所以，利用轉(zhuǎn)基因或同源重組的方法，將人類基因“放置”在小鼠模型上所制備的人源化小鼠模型，大大提高了這類小鼠模型作為模擬 某些人類疾病的有效性。
應(yīng)用
1、在艾滋病、癌癥、傳染病、人類退化性疾病、血液病研究領(lǐng)域等都有廣泛的應(yīng)用；
2、藥物臨床前模擬實(shí)驗(yàn)。
KO-First技術(shù)制作基因敲除鼠
KO-First技術(shù)是通過在內(nèi)含子中插入一個兩邊帶有FRT位點(diǎn)的基因破壞盒來達(dá)到敲除的目的，這個破壞盒含有Splice acceptor，報(bào)告基因和Neo。除此之外，在目的基因敲除的外顯子兩側(cè)各插入一個LoxP位點(diǎn)。因此得到的小鼠是目的基因敲除同時敲入報(bào)告基因與抗性基因的小鼠。通過靈活選擇和Flp/FRT重組系統(tǒng)和Cre/LoxP重組系統(tǒng)，可達(dá)到同時獲得完全性敲除和條件性敲除的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。即?dāng)該小鼠與Flp小鼠交配時，可還原已敲除基因的表達(dá)，獲得基因條件性敲除小鼠，在此基礎(chǔ)上Cre小鼠交配又可獲得目的基因敲除小鼠。
