CRISPR基因編輯
2022-08-14
CRISPR-Pro技術(shù)原理
Cas9/gRNA復(fù)合物在靶位點(diǎn)進(jìn)行切割，產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB：Double-strand break），迫使細(xì)胞進(jìn)行緊急修復(fù)。通常條件下，細(xì)胞偏向于使用非同源末端連接（NHEJ：nonhomologous DNA end joining）的方式對(duì)斷裂的雙鏈進(jìn)行修復(fù)，進(jìn)而造成靶位點(diǎn)基因的插入/缺失突變。CRISPR-Pro技術(shù)采用獨(dú)特的受精卵處理方式讓受精卵偏好同源重組修復(fù)路徑，大大提高同源重組效率，使得DNA大片段敲入（KI）及條件性敲除（cKO）得以實(shí)現(xiàn)。
CRISPR-Pro技術(shù)優(yōu)勢(shì)
1）周期短，效率高；
2）高嵌合率，生殖遺傳穩(wěn)定；
3）可實(shí)現(xiàn)DNA大片段敲入（長(zhǎng)達(dá)15Kb）；
4）可實(shí)現(xiàn)條件性敲除（長(zhǎng)達(dá)4kb）；
5）可實(shí)現(xiàn)大片段敲除（長(zhǎng)達(dá)500kb）。
都更具優(yōu)勢(shì)。
CRISPR-Pro基因敲除常用小鼠模型
完全性基因敲除小鼠
CRISPR-Pro完全性基因敲除小鼠是通過(guò)CRISPR /Cas9基因敲除技術(shù)，針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)和構(gòu)建gRNA與Cas9表達(dá)質(zhì)粒，造成目的基因的功能區(qū)域被敲除，獲得全身所有的組織和細(xì)胞中都不表達(dá)該基因的小鼠模型。
CRISPR-Pro完全性基因敲除包括：移碼突變、片段基因敲除、雙/多基因敲除。
條件性基因敲除小鼠
條件性基因敲除是通過(guò)把兩個(gè)LoxP位點(diǎn)插入到目的基因的一個(gè)或幾個(gè)重要外顯子的兩端以制備出有兩個(gè)floxed小鼠。該floxed小鼠在與表達(dá)Cre重組酶小鼠雜交之前，該基因表達(dá)正常；當(dāng)floxed小鼠與組織特異性表達(dá)Cre酶的小鼠進(jìn)行雜交后，可實(shí)現(xiàn)在特定的組織或細(xì)胞中敲除該基因，而在其它組織或細(xì)胞中該基因表達(dá)正常。
基因敲入小鼠
CRISPR-Pro基因敲入小鼠是利用CRISPR/Cas9基因敲入技術(shù)，針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)、構(gòu)建相應(yīng)的 gRNA質(zhì)粒和donor vector，通過(guò)Cas9核酸酶的切割作用和同源臂的同源重組，引入特定的突變或外源基因。比如在目的基因上引入點(diǎn)突變(模擬人類(lèi)遺傳疾病模型)或?qū)?bào)告基因(如EGFP，mRFP，mCherry，mYFP，或LacZ等)引入目的基因的特定位點(diǎn)，從而可以通過(guò)報(bào)告基因來(lái)跟蹤目標(biāo)基因的表達(dá)；也可以用報(bào)告基因取代大小鼠本身的基因，使KO/KI同時(shí)發(fā)生。
構(gòu)建原理圖：
Rosa26位點(diǎn)基因敲入(基于CRISPR技術(shù)）
Rosa26位點(diǎn)條件性基因敲入(基于CRISPR技術(shù)）
構(gòu)建流程：
技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
1. 外源基因的重組位置確定，更有利于表達(dá)；
2. 結(jié)合Cre-loxP系統(tǒng)，可以使外源基因在特定組織及特定時(shí)間表達(dá)；
H11位點(diǎn)基因敲入小鼠
Rosa26是一個(gè)經(jīng)典的基因插入位點(diǎn)，雖然對(duì)于Rosa26位點(diǎn)的研究較多，但制作多基因插入小鼠時(shí)仍需要其他合適的插入位點(diǎn)。H11（Hipp11）是另一個(gè)可供選擇的插入位點(diǎn)，也是一個(gè)安全區(qū)域，在此位點(diǎn)的插入基因不會(huì)影響其他基因表達(dá)，同時(shí)此插入基因的表達(dá)也不會(huì)受到周邊區(qū)域的影響。
H11位于小鼠 11 號(hào)染色體，是位于Eif4enif1與Drg1兩個(gè)基因之間的一個(gè)位點(diǎn)，于 2010 年由 Hippenmeyer S.發(fā)現(xiàn)，整合到 H11 位點(diǎn)的外源基因可以穩(wěn)定高效的表達(dá)。利用Crispr/Cas9基因編輯技術(shù)，可將外源的基因片段定點(diǎn)插入到小鼠的H11位點(diǎn)。與Rosa26相比，其優(yōu)點(diǎn)是不受旁側(cè)啟動(dòng)子影響，因此更合適用于表達(dá)外源基因。結(jié)合loxp系統(tǒng)，可構(gòu)建組織特異性表達(dá)小鼠模型。
構(gòu)建原理圖：
構(gòu)建流程：
技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
1. 穩(wěn)定性高，后代表達(dá)一致；
2. 實(shí)用性強(qiáng)，能實(shí)現(xiàn)A基因在Rosa26位點(diǎn)及B基因在H11位點(diǎn)同時(shí)過(guò)表達(dá)；
3. 經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，F(xiàn)1代即可開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。